ABSTRACT
El estudio del proteoma permite el entendimiento de la fisiología del organismo, la identificación de marcadores para diagnóstico y pronóstico, la detección de los eventos moleculares que están teniendo lugar bajo condiciones concretas, etc. Además, debido al importante papel que desempeñan las semillas en la dieta mediterránea, tales como los cereales, leguminosas, etc., tanto para la alimentación humana como para la ganadera, este trabajo pretende analizar el perfil proteico de las semillas de distintas especies biológicas (Phaseolus vulgaris, Cicer arietinum, Triticum spp., Zea mays y Quercus ilex). Para ello, se ha utilizado la electroforesis bidimensional (2-DE), una técnica analítica y preparativa de separación que utiliza dos etapas sucesivas, lo cual incrementa la resolución y sensibilidad de la separación de proteínas. En la primera etapa se lleva a cabo el isoelectroenfoque (IE), seguido de la electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE.
Introducción
El estudio de muestras biológicas requiere integrar la información de los experimentos de forma global, y no como fenómenos aislados, debido al comportamiento dinámico y combinado de todas las moléculas que componen a un organismo. El análisis del proteoma permite determinar el perfil proteico de diferentes organismos, con diferentes aplicaciones tales como el diagnóstico de enfermedades, el desarrollo de fármacos, la determinación de la funcionalidad de genes, así como la comprensión de diferentes fluctuaciones en la expresión de estos. El proteoma puede ser definido como “todas y cada unas de las especies proteicas presentes en una unidad biológica, en un estado de diferenciación y desarrollo concreto, bajo un ambiente y condiciones concretas”. Es decir, el proteoma es dinámico, que depende de interacciones moleculares en el organismo, así como de modificaciones post-traduccionales o splicing-alternativo, en un tiempo determinado (Aslam et al., 2017).
El estudio del proteoma se dificulta en eucariotas, debido a que son químicamente heterogéneas, por lo que los protocolos de extracción de proteínas no permiten extraer todas las especies proteicas de una muestra. Además, la abundancia varía en el tiempo y bajo diferentes condiciones de estrés, temperatura, pH, salinidad, etc. Las proteasas presentes en las muestras biológicas, así como otros metabolitos intermediarios, tales como flavonoides en plantas, contribuyen a dificultar su separación.
La ruta de análisis y estudio del proteoma comienza con el diseño del experimento, muestreo y conservación de muestras, siguiendo con la extracción de proteínas, fraccionamiento y purificación. A continuación, la espectrometría de masas permite obtener la huella peptídica en cuestión, que posibilita la identificación y cuantificación de proteínas, para poder interpretar los resultados. Sin embargo, la dificultad de separación de proteínas durante el proceso de fraccionamiento, así como la importancia del estudio del proteoma, son hechos que han conllevado a diferentes científicos al desarrollo de técnicas que posibiliten este fenómeno, con alta resolución y sensibilidad. De esta forma, (O’Farrell, 1975) describe el desarrollo de la técnica de electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida, donde las proteínas se separan por punto isoeléctrico (primera dimensión) y por peso molecular (segunda dimensión, electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE). El hecho de que ambas separaciones se hagan respecto a propiedades diferentes incrementa la resolución y optimiza la separación.
Como se describe en (Aslam et al., 2017), esta técnica es útil para separar alrededor de 5000 proteínas diferentes de forma eficiente, y puede ser aplicable a la caracterización de modificaciones post-traduccionales, mutaciones (la posición del spot cambia de manera detectable si se altera una sola carga) y la evaluación de rutas metabólicas.
La importancia del estudio de las proteínas contenidas en las semillas radica en el papel que éstas desempeñan en las dietas humanas y su consumo en todo el mundo, como el caso de trigo y otros cereales (de Punder & Pruimboom, 2013). Dentro de los grupos de alimentos ricos en proteínas, tales como carne, pescado, quesos, etc., destacan las legumbres (Mariotti & Gardner, 2019). Además, algunos estudios muestran los beneficios que aportan el consumo de semillas a la salud humana, y la relación que presentan con la longevidad asociada a los telómeros (Crous-Bou et al., 2019).
Materiales y métodos
Todos los materiales han sido suministrados por el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Córdoba, así como los dos primeros pasos descritos a continuación (preparación del material biológico y extracción y solubilización de proteínas).
Preparación del material biológico
El material biológico utilizado fueron semillas de cinco especies vegetales: bellota, alubia, maíz, garbanzo y trigo. En el caso de la bellota, se recogieron bellotas maduras del campo y se descartaron aquellas que estuvieran contaminadas por hongos o dañadas por insectos. Posteriormente, se trituró la semilla de bellota utilizando un molino de aspas y un molino analítico. Por último, la harina obtenida se tamizó y se almacenó a 4ºC hasta su uso. En el caso de la alubia, el garbanzo, el maíz y el trigo, las semillas se molieron con un molinillo de aspas y, posteriormente, por un mortero con nitrógeno líquido.
Extracción y solubilización de proteínas
El método utilizado para la extracción de proteínas consistió en la precipitación de las mismas, a partir del material biológico preparado, mediante el método TCA-Acetona (ácido tricloroacético al 10% (p/v) en acetona). El pellet obtenido y recuperado fue solubilizado, para así recuperar la fracción soluble de proteínas.
Cuantificación de proteínas
Mediante el método Bradford (Bradford, 1976) se cuantificó la cantidad de proteínas (μg/μL) presente en cada uno de los extractos proteicos, midiendo la absorbancia a 595 nm de cuatro réplicas por extracto.
Primera dimensión
Para realizar el isoelectroenfoque se utilizaron 60 μg de proteína con 200 μL de solución de rehidratación. Dicha solución contiene DTT y anfolitos previamente añadidos. Las burbujas entre la tira de isoelectroenfoque y la muestra fueron eliminadas, con el objetivo de permitir un correcto paso de la corriente.
Se añadió 1 ml de aceite mineral, para impedir la evaporación de la solución de rehidratación. Las condiciones de electroforesis fueron 50V durante 12-16h para una hidratación activa, siguiendo con 1000V·h (aplicando 4000V durante 2:30 minutos), finalizando con 500V. Una vez finalizó dicha separación, el profesorado encargado realizó tres lavados, y se congelaron las tiras a -20ºC.
Equilibrado de las tiras
Para el equilibrado de las tiras se utilizó, en primer lugar, el tampón de equilibrado 1, que contenía 2% de DTT. En segundo lugar, se adicionó el tampón de equilibrado 2, que contenía 2,5% (p/v) de iodoacetamida. Entre ambos tampones, así como al finalizar el tiempo del segundo tampón, se realizaron tres lavados con tampón de carrera.
Segunda dimensión
Para realizar la electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida SDS-PAGE se prepararon los geles de poliacrilamida al 12,5%, agregando las soluciones que se muestran en el protocolo proporcionado.
La tira de la primera dimensión se puso en contacto con el gel de poliacrilamida, dejando un espacio para la adición de agarosa. Para realizar la electroforesis se aplicó un voltaje de 80V.
Tinción de geles
Los geles se tiñeron con azul de Coomassie coloidal.
Resultados y discusión
Mediante el método Bradford (Bradford, 1976) se cuantificó la cantidad de proteínas de cada extracto proteico. Se midió la absorbancia a 595 nm de cuatro réplicas por extracto y se calculó la concentración de proteínas (μg/μL) gracias a la recta patrón (ecuación 1) proporcionada por la profesora (tabla 1).
Tras la cuantificación, se calculó la cantidad de proteínas totales (extraídas a través del método TCA-acetona y, posteriormente, solubilizadas) para obtener el rendimiento (porcentaje de proteínas totales respecto al peso seco) de cada especie biológica. Se observa que el rendimiento obtenido para las especies que pertenecen a la familia de leguminosas (Phaseolus vulgaris y Cicer arietinum) es significativamente mayor que el rendimiento del resto de especies, destacando Quercus ilex, ya que fue de la que menor rendimiento se obtuvo, encontrándose incluso por debajo del porcentaje de proteínas totales contenidas en las especies que pertenecen a la familia de las gramíneas (Zea mays y Triticum spp) (tabla 1).
Dichos resultados concuerdan con los descritos por otros autores, tales como (Gueguen, 1983) en el caso de las características de las leguminosas, (Singh, 1985) en el caso de la calidad nutricional del garbanzo y (Shewry & Halford, 2002) en el caso de las semillas de cereales. Sin embargo, cabe destacar que se desconocen las variedades de cada especie vegetal utilizada en este trabajo, por lo que los resultados obtenidos podrían variar.
El contenido proteico obtenido (tabla 1) no alcanza el 1% en ninguna de las especies.
Teniendo en cuenta el rendimiento obtenido para las semillas de las mismas especies por otros autores (tabla 2), se deduce la pérdida de otras proteínas que no han podido ser extraídas y/o solubilizadas, mediante los métodos utilizados en este trabajo (TCA-acetona).
Por otro lado, el porcentaje de proteínas extraídas y solubilizadas (tabla 1), no alcanza el 5% de las proteínas totales en maíz, trigo ni bellota. Aunque se han extraído y solubilizado mayor porcentaje de proteínas en alubia y garbanzo, este sigue siendo menor al 10% de las proteínas totales. La principal causa de este evento es la heterogeneidad del proteoma y de la naturaleza intrínseca de las proteínas, que dificulta la existencia de un método que las extraiga todas y de un tampón que las solubilice todas. Algunos pasos intermedios con fenol-cloroformo, así como lavados con metanol, podrían mejorar el porcentaje.
El contenido proteico de cada especie según la tabla 1 se corresponde con los resultados obtenidos tras la electroforesis bidimensional (figura 1), siendo mayor la cantidad de spot en el caso de leguminosas que en el resto de especies vegetales.
Figura 1. Perfil proteico 2-DE de las semillas de alubias (Phaseolus vulgaris), garbanzo (Cicer arietinum), maíz (Zea mays), trigo (Triticum spp) y bellota (Quercus ilex). Se representa en horizontal el pH utilizado en la primera dimensión (4 a 7) y en vertical los marcadores de peso moléculas (kDa) utilizados en la segunda dimensión. Los colores representan los spots proteicos que se tendrán en cuenta para un análisis detallado.Asumiendo que cada spot (figura 1) corresponde con una única proteína, se ha estimado el porcentaje del proteoma que se visualiza tras realizar la electroforesis bidimensional. Para ello, también se tiene en cuenta la cantidad de proteínas totales que contiene cada especie vegetal, obtenido de las bases de datos (Uniprot) y representados en la tabla 3.
2) En el caso de alubia, garbanzo, trigo y maíz corresponde al número de proteínas totales según las bases de datos. En el caso de la bellota corresponde al número de transcritos.
3) Se representa el identificador (ID) del proteoma de las especies vegetales alubia, garbanzo, trigo y maíz según Uniprot
De esta forma, se estima que el gel 2-DE de la alubia representa alrededor del 0,002% del proteoma, el de garbanzo representa en torno al 0,003% del proteoma, el de trigo se aproxima al 0,008% del proteoma, el de maíz supone un 0,0009% y el de bellota alrededor del 0,0011%.
Sin embargo, dicho porcentaje puede variar teniendo en cuenta los siguientes aspectos: en el caso de la bellota, todos los transcritos no tienen por qué ser proteínas, de forma que puede haber menos proteínas que transcritos obtenidos. También, pueden obtenerse diferentes números de transcritos dependiendo del método utilizado (Guerrero-Sanchez et al., 2019). Además, al estar considerando semillas, no tiene por qué estar expresado el proteoma de la especie vegetal por completo. Por otro lado, las bases de datos presentan las proteínas totales que se conocen y se han estudiado, pudiendo dejar fuera otras proteínas que forman parte del proteoma de la planta, pero aún no se conoce o no se ha estudiado. A estas consideraciones se le suman las limitaciones de la técnica de electroforesis bidimensional, donde las proteínas con punto isoeléctrico extremos no estarán representadas, así como otras proteínas que no hayan podido ser extraídas por los métodos de extracción y solubilización utilizados. Con el objetivo de visualizar mayor cantidad de especies proteicas que forman parte del proteoma de cada especie vegetal, se pueden realizar modificaciones en el proceso previo a la electroforesis bidimensional, como en el caso del método de extracción y purificación del extracto proteico.
Considerando la amplia heterogeneidad en la composición química de las especies proteicas de una muestra biológica, debe tenerse en cuenta la combinación de diferentes protocolos de extracción, que separen por solubilidad, carga, tamaño, punto isoeléctrico, hidrofobicidad, forma, etc, a las proteínas de la muestra. Como se explica en (Labrou, 2014), se pueden combinar métodos de baja resolución y alta capacidad (algunos procesos de separación a través de la precipitación, tales como solventes orgánicos, sulfato amonio, etc.), con métodos de alta resolución y baja capacidad (algunos procesos de separación a través de cromatografía, tales como interacciones hidrofóbicas, HLPC de fase reversa, cromatografía de afinidad, etc.).
Además, se puede incrementar la cantidad de muestras (semillas en este caso), así como utilizar otras muestras más representativas. Por otro lado, la combinación de inhibidores de proteasas, como PMSF (inhibe proteasas de serina y proteasas de cisteína), EDTA (inhibe metaloproteasas), inhibidores de proteasas de péptidos, tales como leupeptina o pepstatina, etc., puede mejorar la visualización del resto del proteoma, al disminuir el porcentaje de proteínas degradadas antes de la separación.
Algunas proteínas en mayor cantidad (rubisco) enmascaran a las de menor cantidad. Por lo tanto, para aumentar el porcentaje de proteínas visualizadas se puede enriquecer el extracto proteico a favor de las proteínas escasas, eliminando aquellas proteínas que no interesan o que están en mayor cantidad, utilizando técnicas que separen por afinidad (cromatografía de afinidad), fraccionando el compartimento subcelular de análisis, etc.
La combinación de la electroforesis bidimensional con otras técnicas de visualización proporcionaría mayor cantidad de datos e información. Algunas de estas técnicas complementarias son la cromatografía de afinidad, espectrometría de masas, autoradiografía y fluorografía (tiñen fosfoproteínas), tinción con plata (1 ng de proteínas en la muestra), tinción de zinc negativo con imidazol (límite de detección 15 ng de proteínas), etc.
Destaca el similar patrón que se ha obtenido entre el perfil proteico de la alubia y el garbanzo, así como entre el maíz y el trigo. En las gramíneas, la mayoría de las proteínas se localizan entre 200-40 kDa, mientras que las leguminosas presentan prácticamente todo el rango de marcadores de peso molecular. Este hecho puede estar relacionado a la relación filogenética entre leguminosas y entre gramíneas. Por otro lado, en el caso de las bellotas, la dispersión de proteínas por el gel es menos acusada que en las leguminosas, aunque las proteínas también abarcan pesos moleculares más alejados entre sí, desde 200 kDa hasta 14 kDa, donde destaca el tren de spot a los 31 kDa.
Además, aunque la mayor parte de las proteínas de semilla de alubia presentan un punto isoeléctrico entre 4 y 5, en el caso de la semilla de garbanzo éste se encuentra entre un pH de 5 y 6. Entre las semillas de gramíneas, el punto isoeléctrico de las proteínas es más similar, encontrándose entre 5 y 7 tanto en maíz como en trigo.
Destacan algunos spots obtenidos para cada especie vegetal (figura 1), representados en la tabla 9 con más detalle y, cuyo cálculo, se describe en el anexo (tabla 4,5,6,7 y 8).
Destaca la aparición de un spot (nº1) en torno a los 66 kDa y pH entorno a 5 en todas las especies vegetales (figura 1, tabla 9). Este podría tratarse de la misma especie proteica, o similar, en todas las semillas.
Por otro lado, en el caso de la alubia el spot nº2 y nº3 destacan por su apariencia, de la cual se deducen varias proteínas en un mismo spot, comentado con mas detalle más adelante. El spot nº5, nº6 y nº7 tienen la misma masa molecular y presentan un punto isoeléctrico muy parecido, lo cual puede suponer la existencia de varias isoformas de la misma proteína, modificaciones post-traduccionales, etc.
En el caso del garbanzo, el spot nº2, nº4, nº6 y nº9 destacan por presentar el mismo punto isoeléctrico, aunque difieren en gran medida en la masa molecular, posiblemente debido a proteínas unidas de forma que la carga sea igual para todas, pero los complejos presenten diferente masa molecular. También resalta el nº5 por su apariencia de “tren proteico”, es decir, una mancha negra de la cual se deducen varias proteínas en un único spot.
En el caso del maíz, el spot nº2 destaca por ser dos proteínas con misma masa molecular y carga parecida, lo cual podría ser el caso de dos proteínas que ejerzan un papel similar en la célula. Además, el spot nº4 representado en maíz está ausente en trigo, por lo que puede ser el caso de una proteína que no sea común de gramíneas, sino especifica de maíz.
Lo mismo que en maíz, ocurre en trigo. El spot nº7 y nº8 en trigo parece no sercomún de gramíneas, sino especifico de trigo, debido a la ausencia en el maíz de una especie proteica igual o similar.
El spot nº3 de bellota es un ejemplo de “tren proteico” que indica la existencia de más de una especie proteica. Además, dicho spot destaca del resto de las especies vegetales por ser el que mayor rango de punto isoeléctrico abarca, pudiendo ser consecuencia de funciones especificas de bellota que requieran dichas especies proteicas en mayor medida de aparición que en el resto de especies vegetales. Además, es el único que alcanza un pH de 7 entre todas las especies vegetales. Por otro lado, el spot nº5 parece estar en mayor cantidad en el extracto proteico, en comparación con el resto de proteínas de bellotas. El spot nº7 parece ser único de bellota, aunque resulta dudosa la similitud de masa molecular y punto isoeléctrico que presenta con el spot nº10 de garbanzo. Dicha similitud no se encuentra con ningún spot de otras especies vegetales.
Hasta ahora el análisis de cada spot se ha llevado a cabo considerando que cada uno corresponde con una proteína. Sin embargo, varios indicios indican que este hecho no es siempre así. La aparición de spots con la misma masa molecular pero distinta carga, y viceversa, se puede decir que se trata de la misma proteína con distintos grados de modificaciones post-traduccionales (fosforilaciones, glicosilaciones, etc), o la existencia de proteínas truncadas. Es decir, se puede especular la visualización de diferentes isoformas de la misma proteína. Por otro lado, debido a la heterogeneidad en la composición química de las proteínas, los porcentajes de poliacrilamida utilizados, así como el rango de pH estrecho, no se amoldan a todas las proteínas, dando lugar a separaciones incorrectas en algunos casos.
Para comprobar la composición de las proteínas que componen cada spot, en particular aquellos que se observan como “trenes proteicos”, se puede recurrir a la espectrometría de masas, con el objetivo de determinar la huella peptídica de cada proteína.
Para poder decir que un spot es un marcador genético de la especie, se deberían hacer repeticiones del ensayo por sextuplicado, lo cual resulta difícil en una manipulación de prácticas.
La existencia de diferentes especies proteicas es posible debido a las modificaciones post-transcripcionales que ocurren en organismos eucariotas, con el objetivo de generar ARNm maduros. El procesamiento mediante “splicing alternativo”, donde se reordenan exones y se eliminan intrones, origina diferentes ARNm a partir de un solo gen, que se observa como la expresión de diferentes proteínas.
2) Valores calculados a partir de la ecuación 2 (y = -3,8848x + 8,2571) (Figura 2, anexo).
3) Valores calculados a partir de la ecuación 3 (y = -3,9819x + 8,5165) (Figura 3, anexo).
4) Valores calculados a partir de la ecuación 4 (y = -3,8391x + 8,1677) (Figura 4, anexo).
Para incrementar la resolución y sensibilidad del protocolo utilizado se pueden añadir a la solución que contiene la muestra, previamente al isoelectroenfoque, anfolitos o el tampón IPG, con el objetivo de minimizar los agregados de proteínas que puedan tener lugar debido a las interacciones de cargas. Es común añadir cantidades de base Tris elevadas (40 mM), por lo que habría que diluirlas (5 mM). Además, debido a que muchas proteínas están ancladas a la membrana, los métodos de extracción de proteínas deben ser vigorosos, sin que dañen al resto de proteínas de la célula, como lisis enzimática combinado en soluciones que provoquen un choque osmótico a la célula. La resolución está determinada por la pendiente del gradiente de pH y la intensidad del campo eléctrico, por lo que se puede usar más de 1000V durante el IEF, así como utilizar tiras largas de gradiente de pH inmovilizado (18-24 cm), con gradientes de pH estrechos (pH 3,5–4,5, 4–5, 4,5–5,5, 5–6 y 5,5–6,7), etc. Por otro lado, durante la electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE, la resolución aumenta cuando no se utilizan gradientes de porcentaje de acrilamida, sino un porcentaje único, dependiendo del rango de Mr de la muestra de proteínas.
Para aumentar la sensibilidad del protocolo, la visualización de los resultados obtenidos en la electroforesis bidimensional se puede combinar con otras técnicas, tales como espectrometría de masas o autoradiografía y fluorografía, así como la cromatografía de afinidad.
Conclusiones
La electroforesis bidimensional no sirve para observar el proteoma completo de cada especie vegetal utilizada, debido a la existencia de algunas limitaciones. Aun así, aporta información sobre la posible presencia de diferentes isoformas de proteínas, del fenotipo concreto de una especie vegetal bajo unas condiciones dadas, de la similitud del perfil proteico de especies, etc.
Los resultados obtenidos demuestran que las leguminosas son la familia de especies vegetales que mayor contenido proteico, comparadas con las gramíneas y con bellota. Por otro lado, la similituddel perfil proteico entre familias filogenéticamente cercanas es mayor en el caso de las gramíneas.
Las proteínas de bellota alcanzan pH más extremos, mientras que la mayoría de las proteínas de leguminosas se encuentran dentro del mismo rango de pH (alrededor de 4,5-6).
Bibliografía
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Anexo
Para el calculo de la recta patrón de cada una de las especies vegetales se tuvo en cuenta la distancia electroforética (cm) sin normalizar, debido a que se realizaron las medidas para cada uno de los geles por separado. En todos los casos se obtuvo una ecuación de la recta que se utilizó para el cálculo de la masa molecular de cada spot proteico (tabla 9). En ningún caso se han tenido en cuenta los marcadores de peso molecular extremos (200 kDa y 6,5 kDa), debido a que disminuían la correlación existente entre masa molecular y distancia electroforética, por una incorrecta separación en el gel de electroforesis.
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